土壤微生物的知识

土壤微生物的采集一般有土样采集、增殖培养、培养分离、筛选最后进行纯种分离、毒性试验等。

1、采样：

一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多。选择一定的土壤环境采集土样，将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。

2、增殖培养：

为了容易分离到所需的菌种,让无关的微生物至少是在数量上不要增加,可以通过配制选择性培养基,选择一定的培养条件来控制.例如碳源利用的控制,可选定糖,淀粉,纤维素,或者石油等,以其中的一种为唯一碳源,那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长,而其它微生物就可能死亡或淘汰.这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多.

3、培养分离：

尽管通过增殖培养效果显著,但还是处于微生物的混杂生长状态.因此还必须分离,纯化.在这—步,增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用,而且控制得细一点,好一点.纯种分离的方法有划线分离法,稀释分离法.

4、筛选：

这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件,通过三角瓶的容

量进行小型发酵试验,以求得适合于工业生产用菌种.

关于菌种的识别，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物。

土壤

一般取土壤表层5-10cm处土壤，如果土壤有翻动，应更深一点，避免空气中微生物污染。

1我们一般都用那种封口袋（塑料的），纸袋不容易保持水分。2当天采当天快递回来，不用加冰袋。

3快递一般三天就到，对微生物菌群影响不大。

4在冰柜中4度保存，时间不要超过一个月，尽量随采随做。菌株分离（seperation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需的微生物的过程。

工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并迸行代谢产物鉴别。

菌种可从以下几个途径进行收集和筛选：

（1）向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。国内外著名的菌种保藏机构有：中国微生物菌种保藏管理委员会

（CCCCM），美国典型菌种保藏中心（ATTC），英国国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。

（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。

（3）从一些发酵制品中分离回的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒糟中分离淀粉酶或糖化酶的产生曲等。该类发酵制品经过长期的自然选样，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。

菌株的分离和筛选一般可分为:采样、富集、分离、产物鉴别、生化鉴定几个步骤。

一、从土壤中采样

1克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）＞放线菌（107）＞霉菌（106）＞酵母菌（105）＞藻类（104）＞原生动物（103）

（一）根据土壤特点

1．土壤有机质含量和通气状况

采土样最好的上层是5-25cm、一般每克上中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。总的来说酵母菌分布土层最浅，约5-10cm；霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。

2．土壤的酸碱度和植被状况

3．地理条件：南方、北方

4．季节条件：7-10月

（二）采样方法

用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5-25cm处的土样10-25g，装入事先准准备好的塑料袋内扎好、北方土壤干燥．在10-30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离。以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可采先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取3-4g撒到试管斜面上．这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。

二、根据微生物生理特点取样

1．根据微生物的营养类型

每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的效果。不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉获得能源而生长。

2．跟据微生物的生理特性

三、特殊环境下采样

1．局部环境条件的影响

2．极端环境条件的影响

土壤微生物的分离和纯化

一、实验目的

1、掌握从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。

2、学会根据微生物培养特征初步判断未知菌的类别。

3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。

二、实验原理

土壤是微生物生长和栖息的良好基地。土壤具有绝大多数微生物生活所需的

各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。因此，土壤是微生物资源的巨

大宝库。

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，可用于

培养细菌。链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，对酵母菌和霉菌不起作用。

加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌。重

铬酸钾或苯酚对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，可用于选择分离放线菌。

三、实验器材

1、材料：10cm左右深层土壤。

2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基

3、其他物品：试管、三角瓶、烧杯、量筒、电子天平、精密pH试纸、培养皿、

高压蒸汽灭菌锅、移液枪、枪头、接种环、酒精灯、链霉素(1万单位/ml)、10%

苯酚、无菌水。

四、实验步骤

1、土样采集：取10cm左右深层土壤10g备用。

2、制备土壤稀释液：称取土壤1g，放入有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，

即为稀释10－2的土壤悬液。然后进行十倍梯度稀释，依次制备10－3、10－4、10

－5、10－6、10－7稀释度的土壤稀释液。

3、培养基平板制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培

养基、高氏Ⅰ号培养基各100ml。灭菌后分别倒3个平板。（高氏Ⅰ号培养基灭

菌前加入10滴10%苯酚；马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和

0.4ml1万单位/ml链霉素）

4、接种：用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在

平板上，涂布均匀。细菌选用10－4、10－5、10－6三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨

琼脂培养基，放线菌与霉菌选用10－2、10－3、10－4三个稀释度，分别接种于高

氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基。（一个稀释度一个平板）

5、培养：细菌平板于37℃恒温培养1～2d，放线菌于30℃培养2～3d，霉菌于

30℃培养3～5d，观察。

6、计数：用稀释水样检测平板的菌落计数方法进行计数，报告细菌总数

/(CFU·ml-1)

7、纯化：挑取典型菌落接种于相应平板，培养条件同上，培养纯化。

五、思考题

1、分离放线菌和真菌为什么需要分别加重铬酸钾和链霉素？

2、怎么检验培养皿上的某个单菌落是不是纯培养？

土壤微生物多样性的`研究方法及进展

摘要：微生物是地球上生物多样性最为丰富的资源,微生物资源的开发，是21世纪生命科学发展的主要动力之一。由于微生物的微观性，微生物多样性与其他高等生物相比有许多独特之处。微生物多样性的揭示与研究技术的发展和创新是密不可分的研究技术的进步是微生物多样性研究向前发展的重要推动力量。近年来，随着微电子、计算机、分子生，物学、物理、化学等技术的发展，微生物多样性研究技术也在吸收其他学科先进技术的基础上不断向前发展。各种研究方法的发展使得这种状况有了很大改观。

关键词：土壤微生物，多样性，研究方法

土壤是微生物的大本营，微生物在土壤养分转化与腐殖质形成过程中有着重要的作用。土壤中微生物多样性受耕作方式、地理位置、土壤层次、植被、土壤肥力、气候变化及土壤类型等诸多因素的影响。反之，土壤微生物的多样性又影响土壤生态系统的结构、功能及过程，它是维持土壤生产力的重要组分。研究土壤微生物多样性对于探索自然生命机制、应对全球气候变化、治理各类环境污染、维持生态服务功能及促进土壤持续利用等方面具有重要意义。保持微生物的多样性对于人类农业生产亦具有重要意义。土壤微生物多样性概念土壤微生物是土壤中一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称，通常意义上应当包括古菌、细菌、放线菌、真菌、病毒、原生动物和显微藻类等。土壤是微生物生长和繁殖的天然培养基。土壤微生物多样性是指土壤生态系统中所有的微生物种类、它们拥有的基因以及这些微生物与环境之间相互作用的多样化程度及生命体在遗传、种类和生态系统层次上的变化。

1.土壤微生物研究的主要领域

由于土壤微生物数量巨大，种类繁多，远远超过人们已经描述的数量，这要求在研究土壤微生物多样性，特别是探讨其在土壤生态系统中的功能作用时，要有针对性，选择恰当的研究领域。现在人们最广泛研究的土壤生境或者称为土壤生物区系的影响圈包括，如植物根际即有根植物的根区，主要有菌根菌、根瘤菌和其他有益于或者危害植物的微生物组成。

另外，我们所研究的土壤、湿地及各种沉积物生态系统是相互联系的统一体。对于一些特殊的界面如带、土壤与水生生境、陆地与地下水之间的区域，在这些地带，通常聚集着丰富的微生物和其他生物，它们促进并控制营养物质在相邻生态系统间的转移，这些地带被称为迁移控制带。迁移控制带中的微生物对于研究生态系统间的相互作用具有十分重要的意义。

2.土壤微生物多样性的研究方法

一般而言,一个具有多样性与活性的生物群落的土壤一定具有较为丰富的土壤养分。更重要的是,土壤微生物群落结构和组成的多样性与均匀性不仅提高了土壤生态系统的稳定性和和谐性,同时也提高了对抗土壤微生态环境恶化的缓冲能力。目前土壤微生物多样性已引起国内外学者的极大重视,对土壤微生物群落结构的研究日益增多,研究的方法也在不断的改进。

2.1传统的微生物培养法

传统的微生物培养法就是根据目标微生物选择相应的培养基，然后通过各种微生物的生理生化特征及外观形态等方面进行分析鉴定。这种方法对于衡量小群体多样性方面不失为一种快速的方法。由于这种方法人为限定了一些培养条件，无法全面反映微生物生长的自然条件，常常造成某些微生物的富集生长。而另一些微生物缺失。另外，由于缺乏对微生物真正生存环境的认识，所以迄今为止,只有1%的土壤微生物能够被培养，而大多数只能存在而无法被培养。因此传统的研究方法只能反映极少。

2.2生物标记物法

由于以往的生物化学方法只是对微生物群落的一些指标进行测量(如腺苷酸含量、呼吸放出的CO2量、热放出量等)，所得数据也无法对微生物群落结构进行分析。近20年来学者们潜心研究并确信了另一种可以可靠估价微生物生物量及群落结构的方法-生物标记物法。目前用生物标志物来定量描述土壤微生物群落结构是较为常用的方法之一。这种生物标志物通常是微生物细胞的生化组成成分，或是细胞外分泌的产物。常使用的生物标记物有磷脂酸、酯类多糖类A脂肪酸、磷脂类化合物中的脂肪酸及鞘脂类化合物等。应用这种方法时首先要选择一种适宜的提取剂直接把其从土壤中提取出来，然后对提取物进行纯化，再用合适的仪器加以定量测量。

应用磷脂类化合物的脂肪酸组成来研究微生物群落结构是一种较新的方法,磷脂类化合物只存在于所有生物的细胞膜中,一旦生物细

胞死亡,其中的磷脂类化合物马上消失。生物中的磷脂类化合物能显示出快速的转换率,而且生物可以把相对稳定的磷脂类化合物作为它们的生物量。磷脂类化合物的这些特征和磷脂类化合物与生物的密切关系可以作为土壤微生物群落指纹分析。

2.3核酸探针杂交技术

核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种分子生物学技术。该技术快速、灵敏、具有高度特异性，近年来被广泛应用于微生物多样性的研究中。用于微生物多样性研究的探针主要有三类：双链DNA、单链DNA和RNA以及寡核苷酸探针。杂交方式主要有荧光原位杂交、全细胞杂交、数量印迹杂交及生物芯片。对于环境微生物样品解析而言，最有意义的核酸杂交技术是原位杂交技术，在原位杂交技术中，应用最广泛的是荧光原位杂交技术。

荧光原位杂交是新兴的分子生物学技术，是在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术，是目前原位杂交技术中最常用的方法之一。

2.4分子生物学方法

现代分子生物技术的发展使生物学的研究更加深入,并逐渐成为揭示生命科学规律的有利手段。自从1980年Torsvid第一次从土壤中提取细菌DNA以来,在土壤微生物群落功能评价和方法研究上取得了很大进展。利用分子技术分析核酸使人们逐渐认识到微生物多样性的复杂性。土壤微生物在基因水平上的多样性可以通过微生物中的DNA组成的复杂性表现出来。这种方法首先要从土壤微生物体中有

效的提取DNA或RNA,经过纯化后结合PCR扩增,分子克隆等分子生物技术进行分析。分子生物技术方法可以克服传统培养法造成的信息大量丢失的缺点,能够更全面更客观的对样品进行分析,更精确地揭示土壤微生物种类和遗传多样性。

3.土壤微生物多样性研究展望

随着人们对土壤微生物多样性研究的不断深入，今后的研究工作将集中在如下四个方面：(1)新技术新方法的应用。随着分子生物学技术的发展，目前的新型技术如DNA芯片技术、环境全基因组测序技术和稳定同位素标记技术等，为土壤微生物多样性研究提供了新的方法，从而能将微生物在基因层面上所发生的变异与环境因子相结合，为土壤微生物多样性功能与生态系统平衡以及各功能群落结构之间关系的研究提供有力的支持。(2)各种研究方法有机结合。目前对单一方法的研究已经基本成熟，今后有必要加强对各种研究方法的灵活应用，根据各种方法的优缺点将其有机结合，取长补短，消除单一方法的误差，提供更加全面准确的微生物多样性变化信息。(3)对土壤微生物功能多样性和功能群的研究。土壤微生物功能多样性与土壤功能关系密切，土壤微生物功能多样性是土壤功能的保证，同时也是恢复土壤功能的基础。迄今为止，研究较多的功能多与C、N、S等元素的物质循环和污染物降解过程相关,其他生态过程(例如磷循环)的相关功能研究结果则很少。而微生物多样性研究的一个明显的趋势是将微生物的功能多样性提到了更为突出的位置,在物种尺度之上，更强调功能群的划分,围绕某一土壤生态功能群开展研究正成为土壤